第三代测序在新冠检测中的应用

写在前面的
前期关于这一系列的推送都是基于NGS(next-generation sequencing)技术。随着测序技术的更新，第三代测序技术(third-generation sequencing, TGS)被发展。目前关于三代测序技术的应用已经推广至生命科学的各个领域。因为三代测序技术长读长的优势，一些基因组结构变异(structural variation, SV)能在一次测序过程中被通读。这种优势是NGS测序无法比拟的。因此该技术目前已在医学领域，尤其是在真核生物染色体易位，倒位导致的遗传疾病检测中具有高频应用。

第三代测序技术背景

        目前TGS技术主要分为两类，一类是由美国太平洋生物科学公司(PacBio)推出的SMRT测序(Single Molecule Real-Time Sequencing, SMRT)。即单分子实时测序，核酸分子在被合成过程中通过读取荧光信号识别碱基。另一类是由英国Oxford Nanopore公司推出的新一代基于核苷酸通过纳米孔时合成不同碱基产生的电信号差异以实现单分子测序方法(原理见下图)。目前两种测序技术均是TGS测序中的常用技术，目前网上也有诸多比较二者孰强孰弱的帖子。事实上，我个人认为，两种测序方法在测序性能上不相伯仲。但是由于Nanopore公司推出了可以连接笔记本电脑的U盘式MinION测序仪(见下图)，使得复杂繁琐的测序设备简化为了一个可以随身携带的装置，因此我个人觉得Nanopore在当下甚至是未来更有较高竞争潜力。

错误率高是否仍是三代测序的缺点

        对于习惯于使用NGS测序技术的群体，可能大家对三代测序都有一个共识：单碱基准确识别率低，仅有约85%准确率。实际上，近几年随着技术的进步，三代测序在单碱基识别准确率上已经有了相当大的提升。甚至可以和NGS测序的准确度媲美。比如，以PacBio测序为例。该公司首席生物信息科学家Dr. Aaron Wenger开发了基于CCS(Circular Consensus Sequencing)测序的方法（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31406327/）。该方法通过对线性DNA分子两端连接发卡接头(hairpin adapters)创建SMRTbell模板。DNA聚合酶与接头结合后可以顺着接头移动，并读取碱基。因为发卡接头产生了闭环效应，聚合酶可以进行多次移动并读取碱基。最后针对同一段序列产生多次读取，生成一致性序列。以此提高测序准确率。下图为该技术的原理及效果。相比于早期的PacBio技术来说，单碱基读取错误往往随机地出现在每条reads上。基于CCS技术升级后，可以做到对同一区域进行多次测序，平均误差被显著降低。在论文中，研究团队证明，通过多次读取相同的DNA分子（平均10次）可以产生高质量的测序数据。同时，与传统的NGS测序相比，基于CCS技术升级后的Pacbio测序技术可以做到99.8%的高单碱基准确识别度，与99.9%准确度的NGS测序相比，已经非常接近了，考虑到整个PacBio测序平均可以生成约13.5 kbp的reads与NGS相比在长度上有了相当大的提高。

第三代测序技术在新冠基因组测序中的应用

        将视角放回当下依然严峻的COVID-19疫情。实时检测新冠病毒对于当下防控疫情传播具有显著重要的意义。与PCR相比，高通量测序可以获取完整基因组，对于解析人传人途径，病原溯源及变异株发现都是不可替代的。因此，无论是针对目前国内快速溯源，还是针对国外监测变异体，三代测序技术显然具有较高的应用价值。目前国外已经有团队成功将Nanopore公司推出的MinION测序仪应用于实时监控SARS-CoV-2基因组工作中。如前面的推送所写，对于低载量病毒，获取全基因组序列非常困难。

SARS-CoV-2基因组测序专题（二）

        前面提到的扩增子测序也可以与三代测序相结合。这种方法甚至可以重建部分降解病毒RNA基因组或低病毒载量样本的完整基因组。例如，来自美国的团队发表的一篇论文《High throughput nanopore sequencing of SARS-CoV-2 viral genomes from patient samples》，该论文成功整合了Nanopore扩增子测序技术与Nanopore测序仪MinION及病原大数据追踪网站，NextStrain。成功做到了短时间低成本高效快速获取病毒基因组，并进行基因组溯源。

写在后面的
由于三代测序技术涉及的知识点与理论较多。仅仅一篇短推文很难铺展地介绍三代测序技术，后面准备多推送几篇推送以详细介绍如何将三代测序技术在病原基因组快速获取中应用。