新型冠状病毒患者鼻咽拭子样本的二代测序

写在前面的

宏基因组（宏转录组）测序作为一种检测临床样本未知病原菌的方法，同样在新型冠状病毒全长序列的获得过程中发挥了非常重要的作用。和靶向测序方法相比，基于宏基因组测序（mNGS）在临床样本中的应用还主要包括获得样本中全部微生物基因组信息，从而获得患者的微生物菌群组成，以辅助判断疾病的发展方向以及某些致病菌的混合感染。基于宏基因组测序的优势，相关研究团队研究了新冠病毒感染患者、疑似感染患者以及未感染者鼻咽拭子的微生物组，意图比较COVID-19患者和疑似COVID-19患者，以及健康人群的微生物菌群的组成的差异。

+ + + +

论文信息

论文题目

Metagenomic Next-Generation Sequencing of Nasopharyngeal Specimens Collected from Confirmed and Suspect COVID-19 Patients。

+ + + +

发表期刊

mBio

影响因子

7.867

下面简要介绍这篇论文的主要研究结果

表1. 疑似COVID-19感染者样本特征及测序结果

表格注释

a.   COVID-19严重程度指数，以1 – 4分定义，如下:4.无症状；3.轻症；2.重症；1.危重症

b.   从开始出现症状到采集样本的天数。

c.   可能引起共同感染的病原体。

d.   RT-PCR检测疑似新冠阳性样本。

e.   RT-PCR检测疑似新冠阴性样本。

f.   Ct:循环阈值；SD:标准偏差；-:未知信息；NO ID:即未被Cosmos ID识别的样品；NA: 不适用。

从表1可以看出鉴定SARS-CoV-2读取范围从1min (Ct：16.0) 到15 h (Ct, 33.4)。在几个样本中，没有检测到新冠基因序列，可能是因为过多的宿主核酸序列掩盖了新冠基因的测序。但是CT值的大小并不影响新冠核酸序列reads数。在40例临床样本中有5例新冠患者检测到了高丰度的临床病原菌。包括流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、人偏肺病毒(hMPV) 、人类α疱疹病毒，卡他莫拉菌在COVID -19阴性样本中被检测到。

图1：宏转录组测序样本的各个特征与对应测序结果的关系。

图a到f上的颜色表示患者症状的严重程度，1-4代表不同的程度。1：无症状；2：轻症；3：重症；4：需要呼吸机；黑色代表样本出现的症状不清楚。图g到i的颜色代表出现症状到采样的时间天数。黑色表示采样的时间不确定。

a.   匹配到SARS-CoV 2的测序reads数与人基因组reads数的关系。从图a可以看出新冠基因组的reads数和测序背景人类基因reads数并没有线性关系，宿主基因组的比例不影响病毒测序reads数。

b.   RT-PCR检测的CT值和采样天数的关系。将所有的CT值和采样的天数拟合出来，症状严重的患者的数值更符合线性关系。从出现症状到采样天数越久，其检测的CT值越高，病毒载量越少。

c.   RT-PCR检测的CT值和cosmosID软件分析新冠基因组reads数总匹配比例的关系。新冠reads数的比例和检测CT值并没有明显的线性关系，在CT值都为20左右时，不同的样本新冠的reads数的比例有很大的差异。

d.   RT-PCR检测的CT值和新冠基因组覆盖度的关系。RT-PCR检测的CT值和新冠基因组的覆盖度不成明显的线性关系，但是在CT值接近或者大于30之后，新冠基因的覆盖度基本为0.

e.   RT-PCR检测的CT值和cosmosID分析的新冠reads数的log值的关系。从这两个数值明显没有关联性，新冠的reads数和CT值不成比例关系。

f.   RT-PCR检测的CT值和新冠基因组的reads数在总测序reads数的关系。从图中明显可以看出CT值并不能反应新冠的reads数在总reads数中的比例。但是当RT-PCR 的CT值小于20时，新冠的reads数相较于CT值大于20的比例高。

g.   RT-PCR检测的CT值和新冠基因组覆盖度的关系。当采样时间<7天时，RT-PCR的CT值<20时相较于CT>20的覆盖度高一点，但并不绝对。当采样时间>8天时，CT值较低，不能说明问题。

h.   RT-PCR检测的CT值和cosmosID分析的新冠reads数的log值的关系。

i.   RT-PCR检测的CT值和新冠基因组的reads数在总测序reads数的关系。

图2：宏基因组测序分析SARS-CoV 2 阴阳性样本微生物多态性。使用RT-PCR判断样本阴阳性。a-c：宏基因组多样性的alpha分析；d-f：宏基因组多样性的beta分析。

a． 新冠阴阳性样本在物种水平上的多样性（shannon多样性）。

b． 新冠阴阳性样本在物种水平上的多样性（chao多样性）。

c． 出现症状到采样天数在物种水平的多样性（shannon多样性）。

d． SARS-CoV 2阴性和阳性样本微生物菌落组成多样性的Bray-Curtis分析。

e． PCR和测序阳性对微生物菌群的组成多样性的Bray-Curtis分析。

f． 不同样本的症状严重性对微生物菌群组成多样性的Bray-Curtis分析

分类层级上样本的微生物菌群在family和genus上没有明显差异，但是SARS-CoV 2阴阳性样本在species多样性丰度上确实表现出明显的多样性差异。出现症状到采样天数的不同，不构成统计学的上的差异。

图三：新冠患者的微生物菌群组成变化。

a．  新冠阳性样本和阴性样本总体上的微生物菌落组成差异。

b．  新冠阳性样本和阴性样本个体的微生物菌落组成差异。

在新冠阳性样本中，有非常明显的物种丰度的差异，尤其是丙酸杆菌的丰度要比阴性样本高出30%。并且在新冠阳性样本检测到的reads也是由比较单一的微生物物种组成。

+ + + +

写在后面

本篇作为本人阅读基因组测序文章的开篇之作，有很多地方的理解可能还不够透彻，如有疏忽或者理解不当的地方，敬请各位留言指正，感激不尽。

参考文献：Mostafa HH, Fissel JA, Fanelli B, Bergman Y, Gniazdowski V, Dadlani M, Carroll KC, Colwell RR, Simner PJ. Metagenomic Next-Generation Sequencing of Nasopharyngeal Specimens Collected from Confirmed and Suspect COVID-19 Patients. mBio. 2020 Nov 20;11(6):e01969-20. doi: 10.1128/mBio.01969-20. PMID: 33219095; PMCID: PMC7686804.