新一代宏基因组测序用于混合肺部感染的诊断

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实验背景

肺部感染是世界范围内死亡和发病的一个主要原因。混合型肺部感染的风险很高，特别是免疫功能低下的患者。混合型肺部感染患者可能有不同的抗生素谱，临床表现相较于单一细菌性肺部感染的患者更为严重。然而，由于目前常规检测方法在病原体检测灵敏度等方面的局限性，就需要快速灵敏的病原检测方法。由此催生了第二代测序(NGS)技术，NGS技术也被称为高通量或大规模并行测序，是一种允许数千到数十亿个DNA片段同时独立测序的技术。宏基因组新一代测序(mNGS)是一种非常有前途的病原体检测技术。然而，关于mNGS在混合性肺部感染中的应用报道却不多。

为了比较mNGS技术和传统检测方法的优劣性，作者选择了自2018年7月至2019年3月，共纳入的55例病例进行回顾性分析。根据临床诊断分为混合性肺部感染36例(65.5%)和非混合性肺部感染19例(34.5%)。比较mNGS与常规试验在混合肺部感染诊断及病原鉴定方面的性能。

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实验方法：

样本来自于天津医科大学综合医院疑似肺部感染患者的肺活检和支气管肺泡灌洗液(BALF)。提取样本中的核酸建库，用BWA的方法分析，去除人类基因组序列。为了保证分析的质量，提高分析的可行性，删除了一些短的reads序列。感染病原菌的判断标准：1，细菌培养/组织病理学检测是阳性。2：同一种细菌至少出现50中不同的reads序列。3：至少含有一个结核分枝杆菌的reads片段。

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实验结果：

在55例样本中，和传统的检测方法相比，mNGS具有更高的灵敏度，但是特异性却不如传统的培养方法。

表1mNGS和常规检测的结果对比

如表1所示，mNGS诊断混合肺部感染的敏感性明显高于常规检测(97.2% vs 13.9%;P< 0.01)，但是其特异性却低于常规检测(63.2% vs 94.7%;P = 0.07)。mNGS阳性预测值为83.3% (95% CI, 68.1 ~ 92.5%)，阴性预测值为92.3% (95% CI, 62.1 ~ 99.6%)。常规检测和mNGS检测结果均为混合性肺部感染5例(9.1%)，但两种方法检测结果一致的只有1例(1.8%)。综上所述，mNGS检出病原菌与常规检出病原菌一致3例(5.5%)，仅1例(1.8%)为混合肺部感染（图一）。根据我们的数据，mNGS比常规检测具有更广泛的病原体检测范围。特别是mNGS的应用提高了肺部真菌感染的诊断水平。55例病例中，mNGS检出鉴定真菌31例(56.4%)，其中常规检测同种真菌阳性10例(18.2%)。mNGS检出的最常见病原体是人巨细胞病毒，在19例混合肺部感染中有检出，占34.5%。混合感染组中检出人巨细胞病毒和耶氏肺孢子虫共同感染有7例，占12.7%。

mNGS是一种很有前途的检测混合肺部感染共病原体的技术，在检测速度和灵敏度方面都有潜在的优势。mNGS不仅可以检测出普通的检测方法可以鉴定到的病原菌，还可以检测罕见的病原菌和某些常规不能培养的病毒，具有非常高的灵敏性。

图一mNGS和常规检测混合型肺部感染

mNGS和常规方法诊断混合型肺部感染。在21例混合型样本中，mNGS除了曲霉外，还检测到了病毒。在所有样本中的6例，mNGS和常规检测方法的结果不一样，有一例常规培养出了真菌和新隐球菌，但是mNGS没有检测到，但是mNGS检测到了肺炎克雷伯等常规方法没有检测到的菌种。即便有mNGS没有检测到的病原菌，但是因为mNGS不需要培养，可以同时鉴定出罕见的病原菌和病毒，大大简化了常规检测的流程，所以mNGS在检测混合型肺部感染中具有很好的辅助作用。另外在某些常规检测认为是阴性的样本中，mNGS也鉴定出了病原菌，极大的提高了临床应用中病原鉴定的灵敏度。

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理论上，只要有足够的reads序列和足够深的测序深度，尽量将所有的reads序列在后续拼接中都用到，当然这会很大的增加工作量，是可以将所有的物种都可以鉴定出来的。另外在临床患者中经常有早期药物的治疗，并且在培养过程中，由于样本需要进行预处理，极有可能影响后续的培养过程，造成假阴性结果的出现，从而影响医生的判断，mNGS就可以很好的克服这些问题，为临床疾病的检测提供一个更加可靠的新思路。