严重急性呼吸综合征冠状病毒和蝙蝠源类冠状病毒受体使用的差异

基于不同蛋白质序列的系统发育分子表明，蝙蝠中SL-CoV和人和果子狸中的SARS-CoV应该区别于其他组CoV放在一个单独的亚组G2b之中，G2b组在S蛋白的N端区域展示出差异。

不同ACE 2的N端序列对比。

可以发现蝙蝠的RpACE2分子和其他哺乳动物的ACE2很相似，氨基酸的序列相似性和人ACE2和果子狸ACE2的同一性为81%，与小鼠和大鼠的序列相似性为77%。

用蛋白质印迹法分析蝙蝠ACE2在HeLa细胞中的表达。

图片表明，RpACE2能够在HeLa细胞中高效表达，利用抗RpACE2的抗体也能够识别huACE2和PcACE2。三种ACE2的分子表达水平相似，电泳分析显示，它们的迁移率也相近，大小大约为90-100kD。

免疫荧光共聚焦显微镜检测ACE2的表达。

从左到右依次显示表达的ACE2，细胞核染色和双重染色，从上到下显示huACE2、pcACE2和RpACE2的HeLa细胞。结果显示，在检测三种ACE2分子时，HaLe细胞均能检测到，第四列的对照细胞没有荧光。

ACE2活力检测。

相比于对照组HaLe细胞核TBS 缓冲液，表达了三种ACE2分子的细胞膜分离的活力显著提高，然而再加入了EDTA 之后，所有的酶活力均降低。EDTA 是一种蛋白酶抑制剂。这表明三种ACE2分子都是表达细胞膜相关的蛋白酶。

S蛋白的表达和掺入假病毒的分析。

S蛋白的表达和正确掺入假病毒可以通过三种方法检测，1：S特异性抗体对沉淀的病毒颗粒进行蛋白质杂交分析；2：p24单克隆抗体对沉淀的病毒颗粒进行wb；3：电镜直接检查病毒颗粒。

A：BJ01-S和Rp3-S基因全都转染到293T细胞中，并且有效的得到了表达，表达的S蛋白整合到假病毒中。

B：电镜下的病毒。含有BJ01-S 和Rp3-S蛋白的假病毒显示出冠状病毒的特征，对于两种重组蛋白，CS14-608的S蛋白可以整合到假病毒中，和之前的两种是一样的但是对于CS424-494，虽然S蛋白的表达是正常的，但是假病毒似乎不能用WB和电镜检测到CS蛋白。P24的组装和表达是正常的

利用假病毒感染HaLe细胞时的荧光素酶活性。

在利用BJ01-S的假病毒时，在HeLa-huACE2和HeLa-pcACE2中高表达，但是在HeLa-RP细胞中检测不到表达，CS14-608的表达和前者相似。但是CS424-404和Rp3-5 在三种细胞中都不能进行表达。

已知Rp3-S蛋白能够介导细胞进入，只要ACE2结合成分结合到其分子的N末端区域。为了确定从不能够结合人ACE2到能够结合人ACE2分子的转变所需要的最小转变区域，构建了一系列的重组蛋白，如图所示。

A：氨基酸的位置信息

B：各种蛋白的WB分析

C：假病毒活力的测定。

通过使用S-特异性和p24-特异性抗体的wb分析293T细胞中的S蛋白表达及其结合到每个构建体的假病毒。尽管所有构建体的S蛋白表达水平相似，但在掺入方面观察到显著差异。S蛋白在来源于CS371-608的假病毒中检测不到，在嵌合体CS310-608、CS45-608和CS310-518中仅微弱检测到。检测了HeLa-huACE2中所有CS构建体的感染性，并进行若干观察。除了嵌合体CS417-608和CS371-608产生背景水平的荧光素酶活性之外，所有嵌合体都表现出显著水平的荧光素酶活性，这表明含有这些CS蛋白的假病毒能够使用huACE2进入细胞。从这些结果可以推断，BJ01-S的氨基酸310至518区域是将Rp3-S转化为人ACE2的最小区域。

参考文献：Wuze Ren等. Difference in Receptor Usage between Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Coronavirus and SARS-Like Coronavirus of Bat Origin