联动专题（超级细菌&生命科学哲学）：噬菌体辅助细菌感染

超级细菌与生命科学哲学的联动：噬菌体辅助细菌感染

写在前面的
伴随着抗生素过度使用而产生的超级耐药菌越来越多，噬菌体曾一度被科学家认为是替代抗生素最佳的生物制剂。然而随着临床治疗案例的增加，噬菌体逐渐体现其弊端。上一篇推送说到了细菌同样可以通过适应性进化对噬菌体产生抗性。事实上，适应性进化以获得噬菌体抗性对于细菌而言是普遍存在的现象。结合演绎推理、捕食者与被捕食者模型，如果细菌无法对其“天敌”–噬菌体产生抗性，那么这种细菌早已灭绝。由于细菌的灭绝，这类噬菌体也无“食物”来源，它们也无法继续增殖最后灭绝。长此以往，这对病毒-宿主都走向了灭绝。而事实上自然界中存在大量的噬菌体和细菌，这反过来也说明噬菌体-细菌在“捕食”与“被捕食”过程中都在互相进化，最后维持了一个适当平衡。如果说噬菌体抗性性状的存在为噬菌体在临床治疗的推进应用中带来了巨大阻碍，那么今天要说的一个故事甚至可以算将噬菌体治疗的应用推到了至暗时刻！

一种溶原性噬菌体辅助其宿主菌感染机体

题目：Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection
发表期刊：Science

图1.论文基本信息

铜绿假单胞菌的临床治疗背景

         铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, Pa)，是一种革兰氏阴性菌。这类细菌通常发现于伤口、压疮等病灶部位。由于临床上发现的铜绿假单胞菌通常都是耐药性细菌，因此此类细菌已经导致了临床上较高的与之相关发病率与死亡率。由于目前仍然没有已经批准的疫苗可以使用，因此预防Pa感染仍然是目前临床替代质量的首要策略。世卫组织(WHO)也将Pa归纳为对人类健康风险最大的“重要病原”之一。
        从免疫学角度浅谈Pa治疗：一般情况下机体清除铜绿假单胞菌的临床感染依赖于免疫系统分泌有效量的肿瘤坏死因子(TNF)以激活巨噬细胞等的吞噬作用及这类细胞良好的吞噬活性。

溶原性噬菌体Pf的鉴定与临床分布

        Pf是来自于铜绿假单胞菌基因组内的溶原性噬菌体。这里特别解释一下什么是溶原性噬菌体：与裂解性噬菌体不同，溶原性噬菌体在感染宿主后一般情况下不会马上在宿主内增殖、裂解宿主，而是将其核酸整合到宿主基因组中以和宿主共存。在特定情况下，人为添加诱导剂可以使得溶原性噬菌体恢复裂解活性从而杀灭细菌。
        研究团队通过20个月的时间从医院内搜集铜绿假单胞菌感染病例样本，这期间他们总共搜集到37名患者属于铜绿假单胞菌感染。在这37名患者中，研究者通过PCR方式鉴定出有25名患者（占比约68%）检出Pf噬菌体阳性（图2，A-C）。进一步的，研究者记录了Pf检出样本与创伤时间的关系。他们发现Pf阳性检出率与创伤时间存在正相关（图2，D），创伤时间大于6个月Pf阳性检出率显著增高。为了进一步证明他们的猜想，研究者分别对含有Pf的铜绿假单胞菌(PAO1)和不含Pf的铜绿假单胞菌(PAO1△Pf)进行了人为创伤实验的小鼠模型建立并观察三天内是否有菌感染（图2，E-G）。通过荧光标记菌株，研究者发现携带溶原性噬菌体Pf的菌株PAO1相比于不携带此噬菌体的菌株感染速率显著大，同时感染PAO1的小鼠生存率也显著低于不携带此噬菌体的小鼠，固定时间内存活小鼠的体重比较也显示感染PAO1的小鼠比另外一组显著低（图2，H-K）。如上数据清晰提示携带Pf的Pa在感染速率和致病性上都显著高于不携带Pf的Pa。

图2.携带溶原性噬菌体Pf的铜绿假单胞菌临床诊断和创伤感染的小鼠模型构建

Pf噬菌体可能引起抗病毒免疫及阻碍免疫清除细菌

        前面的实验提示携带了Pf噬菌体的铜绿假单胞菌（Pa）具备更严重的致病性，考虑到人体清除Pa的免疫机制，研究者推断可能Pf噬菌体阻碍了相关吞噬细胞的吞噬功能或影响了天然免疫分子的分泌。因此研究者又开展了相关实验：首先，他们分别测定了在存在Pf和不存在Pf的情况下，吞噬细胞对Pa的吞噬量。相比之下，研究者发现当存在Pf噬菌体时，巨噬细胞吞噬的Pa数量减少了10倍（图3，A-B）！此外，如果将Pf移植到感染了不携带Pf的Pa样本中后，也会导致被移植的样本中吞噬细胞对Pa吞噬能力降低。经过进一步研究，研究者确定了Pf是直接抑制吞噬细胞活性从而降低了对Pa的清除能力。
        由于肿瘤坏死因子TNF对于Pa的清楚至关重要。研究者进一步探究Pf是否影响了TNF的产生。首先研究者通过实验手段纯化出了Pf噬菌体，在与PBS对照组比较下，携带有Pf的实验组TNF分泌显著减少。此外，研究者还加入了LPS（革兰氏阴性菌含有的脂多糖）、海藻酸盐等做对比。而这些物质都可以显著刺激TNF的分泌，但是在存在这些物质的情况下，Pf噬菌体仍然可以抑制TNF的分泌（图3，E-G）。而且TNF分泌的抑制还体现出Pf的浓度和时间依赖现象（图4，A-B）。奇怪的是，当研究员对Pf存在时间内的编码TNF的mRNA水平定量时，确没有发现相关mRNA水平的降低（图4，E）。因此研究员怀疑Pf并没有直接抑制TNF mRNA的表达。由于I型干扰素可以抑制TNF的分泌，研究员将目光锁定在了IFN I的分泌上。果不其然，Pf促进了IFN I的分泌，从而抑制了TNF分泌。由此，研究者确定了Pf可以一方面抑制吞噬细胞吞噬活性、一方面促进IFN分泌从而抑制TNF的分泌从而引起机体对Pa清除的免疫抑制反应。

图3，Pf介导Pa清除的免疫抑制相关实验探索

图4，Pf引起免疫抑制的机制解析

曲线救国：发展抑制Pf噬菌体的疫苗

        研究进行到这一步并没有结束。研究人员虽然回答了Pf噬菌体如何通过免疫抑制机制从而阻碍机体对铜绿假单胞菌的清除。但是在尚未有铜绿疫苗的情况下如何治疗如虎(Pa)添翼(Pf)的铜绿感染呢？既然Pa很难对付，那么只能去对付Pf。于是研究人员通过蛋白质序列分析，鉴定了Pf蛋白中一段保守蛋白（CoaB）亚单位（图5，A）。并设计了相关疫苗。通过进一步实验发现接种了CoaB表位的疫苗可以将创伤部位的Pa感染降低一半（图5，B）。由于免疫反应本身可以影响创伤感染的发生率。研究者将由机体响应CoaB亚单位疫苗产生抗体注入小鼠。与对照比较，接受了单克隆抗体的创伤皮肤中伤口感染率显著降低（图5，C），在加入抗体阻断剂后这种保护效果又消失（图5，E）。这证明了针对Pf的体液免疫反应可以保护Pa的感染。

图5.针对Pf噬菌体的亚单位疫苗及治疗效果评估

点评

        这一项研究绝对是一次意义重大且漂亮的研究。该研究不仅将一个科学问题从源头到源尾清晰地探究明白。而且还通过实际方式对这一问题给出了解决方案。在传统的认知中，噬菌体都是被认为对抗细菌感染的有利生物制剂。然而，这一项研究点明了万事并非非黑即白这一科学哲理。噬菌体-细菌-机体三者的关系比我们想象得更复杂。噬菌体也可能扮演了协助细菌感染的角色。在论文中，尽管研究者指出了Pf噬菌体促进了I型干扰素的分泌。由于I型干扰素具有抗病毒活性，但是读者千万不要狭隘地认为这种噬菌体可以为抵抗其他病毒的感染提供保护。我认为这个噬菌体之所以促进了机体分泌干扰素，是因为它本身加重了细菌的感染。机体将其视为病毒，从而增强干扰素分泌以抵抗此噬菌体。如果将此类噬菌体应用于抗病毒治疗中，那么会承担细菌性感染显著增大的风险。

写在后面的
本次推送是第一次联动两个专题（超级细菌和生命科学的底层代码），后面我们会继续做出一些联动更多专题的推送。