联动专题（超级细菌&病原检测）噬菌体辅助病原菌检测

超级细菌与病原检测的联动：噬菌体辅助病原菌检测

写在前面
经过多期关于超级耐药细菌的推送，我们知道噬菌体作为细菌病毒，能够专一且有效地杀死目标细菌，在耐药细菌感染治疗中具有先天的优势，那么噬菌体专一性杀菌的特性能否应用于病原菌检测呢？今天的这篇推送将基于一篇文献介绍如何把噬菌体与病原菌检测建立联系。

探索基于噬菌体的鲍曼不动杆菌血流感染的高灵敏度实时PCR检测方法

题目：Exploring a phage-based real-time PCR assay for diagnosing Acinetobacter baumannii bloodstream infections with high sensitivity
发表期刊：Analytica Chimica Acta
文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30442396/

血流感染之脓毒症的临床检测背景

       脓毒症是一种严重的血流感染(Bloodstream infection, BSI)，其特征是对血液中微生物的全身炎症反应。它是全球重症监护病房的主要死亡原因，脓毒症的死亡率为10% – 20%，严重脓毒症的死亡率为20% – 50%，脓毒症休克的死亡率为40% – 80%。及时诊断脓毒症对治疗和降低死亡率至关重要。传统诊断脓毒症的方法是血培养，血培养依赖于目标细菌的培养和分离，是目前诊断和鉴定BSI病原体的金标准。而以血液培养为基础的方法耗时较长，通常需要48 h-120 h进行病原菌分离，然后进行细菌鉴定和药敏试验。并且血培养敏感性较差，假阴性率高。此外，基于聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法通常扩增细菌的某些特定基因，灵敏度高、速度快，能够快速检测血液中的细菌病原体和诊断脓毒症。然而，传统的基于病原体的PCR方法不能区分细菌的死活，并且仅限于特定的基因，容易给出假阳性结果。
       烈性噬菌体可以通过胞内裂解杀死宿主细菌。一旦噬菌体感染宿主，单个宿主细胞就会被裂解并释放出数百个噬菌体子代。因此可以通过检测细菌释放的内容物如β-半乳糖苷酶或噬菌体是否扩增开发细菌检测系统并且该系统能够同时判断样本中是否存在活细菌，这对于临床诊断具有重要意义。此外，在基于噬菌体的细菌检测中，基于内容物的检测灵敏性较低，基于qPCR的方法具有更高的灵敏性，能够满足在复杂血液样本中的细菌检测。因此该研究建立了一种基于噬菌体的快速、灵敏的BSI细菌实时PCR检测方法，通过比较血清样本加入噬菌体前后一定时间内噬菌体Ct值的差异，检测噬菌体在该时间内是否扩增，从而判断样本中是否含有目的细菌。该方法能在4 h内检测100 mL血清样品中的10 CFU细菌，具有较高灵敏度。该检测方法的概念图如图1所示。

图1. 基于噬菌体的快速、灵敏的BSI细菌实时PCR检测方法概念图。

基于噬菌体检测病原菌qPCR方法的建立

       一个良好的检测方法首先需要具有较好的特异性与灵敏度，该研究选择能够特异性裂解鲍曼不动杆菌LB8的噬菌体p53作为实验材料，根据p53的基因组序列设计了检测用的引物和探针，该引物探针具有较好的特异性，在图2A所示的目标中，特异性地扩增噬菌体p53的片段。同时检测p53的Ct值与噬菌体的浓度具有良好的线性关系，保证qPCR的检测结果与噬菌体粒子的实际数量一致（图2B）。

图2. 基于噬菌体p53序列的引物/探针的特异性检测; (B)噬菌体p53浓度(PFU/mL)与Ct值的关系。
      其次要确定基于p53噬菌体检测宿主细菌的间隔时间，该时间间隔是由噬菌体的burst time决定的。因此先用10^4 PFU/mL和10^6 PFU/mL两种浓度的p53噬菌体探究不同浓度的p53是否会影响噬菌体的burst time，即爆发时间。结果显示，p53的爆发时间为培养后的40 min，由此判断噬菌体的扩增能够被qPCR检测到的时间约为40 min，确定了后续基于p53检测鲍曼不动杆菌的时间间隔为40 min。

图3. 噬菌体p53在10^4 PFU/mL和10^6 PFU/mL浓度下，与宿主菌LB8比例为1:1时的动力学曲线。箭头表示培养时间为40 min，这是p53的爆发时间，两种p53测试浓度的结果一致。
      最后需要确定噬菌体p53的最佳使用量，以达到最高的检测灵敏度。把p53从10^6 PFU/mL到10^2 PFU/mL进行倍比稀释，在每个p53浓度下，测试宿主细菌浓度范围是从100 CFU/mL到10^6 CFU/mL。图4显示了p53和LB8混合物共培养时Ct值与培养时间的关系，每40分钟测一次。结果表明，当噬菌体p53的浓度为10^3 PFU/mL时(图4D)，敏感性最高，可检测到100 CFU/mL的鲍曼不动杆菌。因此选择10^3 PFU/mL噬菌体p53进行后续检测血清样本中的细菌。另外，培养时间越长，灵敏度越高，如图4D所示，160 min时每组Ct值的变化更加明显。

图4.不同浓度的（A. 10^6 PFU/mL B. 10^5 PFU/mL C. 10^4 PFU/mL D. 10^3 PFU/mL E. 10^2 PFU/mL）p53噬菌体在培养不同时间后检测不同浓度的(从 100 CFU/mL 到 10^6 CFU/mL)宿主鲍曼不动杆菌LB8。

模拟临床血清样品测定检测方法的可靠性

      由于血清样本更加复杂，因此需要测定该方法在复杂样本中的稳定性和灵敏度。首先分析了Ct值对不同孵育时间点的依赖关系。图5A中的数据表明，通过对p53噬菌体和LB8宿主进行180 min的培养，血清中可检测到10^2 CFU/mL的细菌。图5B表明培养180 min时的ΔCt与模拟血清样品中细菌数量呈良好的线性关系，证明该检测系统可适用于临床血清样品。细菌浓度较低(10 CFU/mL和100 CFU/mL)时通过增加实验体积和培养时间来检测。

图5. 用10^3 PFU/mL p53噬菌体检测模拟血清样品中的鲍曼不动杆菌LB8。A. 在宿主菌浓度从100 CFU/mL到10^7 CFU/mL时，Ct值随时间的变化，培养180min时，ΔCt明显。B.当噬菌体浓度为10^3 PFU/mL时，ΔCt (180 min和0 min时的Ct值变化)与宿主菌浓度呈线性关系。

写在后面
上述开发的检测方法可以满足在4h内对临床血清样本中进行准确的病原活菌的检测，不依赖于常规耗时的细菌培养，该方法还可以用来检测不生长或生长太慢的细菌，大大缩短了临床诊断的时间。快速和准确的诊断将指导正确使用药物，及时控制疾病，并通过减少抗生素耐药性的进一步发展来拯救生命。但是该方法仍然具有局限性，只能检测p53敏感的鲍曼不动杆菌，不能检测所有的鲍曼不动杆菌。因为噬菌体对宿主具有专一性，目前还没有发现感染一个物种的所有菌株的噬菌体，未来可能需要设计用于病原检测的工程噬菌体来解决这一问题。