宏基因组中人类粪便样本处理方法的比较

写在前面：

目前已经有越来越多的证据表明微生物和人类的健康有着密不可分的关系，尤其是近年来肠道微生物菌群研究的发展，使得越来越多的重要微生物菌群被发现。但是，根据相关推算，仍有更多肠道微生物未被发现。其中一个主要原因是不同的微生物组基因组提取方法或试剂盒对同一样本的核酸提取效率不同。因此2017年一篇发表在Nature Biotechnology 上的文献针对这个问题，开展了比较21种目前常用微生物基因组提取试剂盒及非试剂盒的提取方法对微生物核酸提取效率的差异，分别以人类粪便样本和模拟样本为对象，以宏基因组测序结果中各微生物丰度与真实丰度接近度为指标，企图寻找出一种最佳的提取基因组的方法。

论文信息

论文题目：Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies

发表期刊：Nature Biotechnology

影响因子：54.908

主要结果

论文将提取方法按1-21进行编号。（具体的21种方法我们后期会详细整理为Protocal与大家分享）。下面我们主要概况论文的研究结果。接下来主要介绍一下这21种方法在宏基因组水平上的提取效果。

图1.  21种提取方法提取的DN质量和片段大小。横坐标代表21种不同的方法（按1~21命名）纵坐标代表DNA片段小于1.8kb的占比(a)；提取的DNA的质量（b）

图一论文发现不同的试验方法对于DNA的质量和片段大小有很大的影响。比如，实验方法18的DNA质量和完整性比其它实验方法高。DNA质量过低或者过于碎片化的步骤基本可以不做考虑（标红）。

图2.  21种提取方法分析单拷贝的生物学标记基因（a）和成簇的同源基因组（b）

图二的结果表明因为样本本身所带来的差异明显大于使用不同的提取方法带来的差异，提取方法组间差异显著大于组内在提取核酸上的差异，这也在另一方面说明除了样本之间这些非人为可控的因素外，不同基因组提取方法在微生物组核酸提取上确实有不同效果。

图3：21种提取方法在模拟样本中提取细菌基因组丰度的对比。

另外，为了更加充分挖掘21种方法中更优越的方法。作者预先设置好模拟样本，在模拟样本中加入已知比例的细菌，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。分别用21种提取方法来对模拟样本进行基因组的提取，用各个细菌测序后检出的相对丰度和实际的丰度进行对比。图3表明不同的提取方法对于细菌基因组的提取有明显的不同，尤其是对于革兰氏阳性菌的影响较大，推测这可能和阳性菌较厚的肽聚糖层有关。

图4：不同的裂解方法对于模拟样本基因组提取的差异性及相关性。

从图4可以看出不同的裂解方法对于基因组的提取有着不同的作用，使用直径小于0.5mm的破碎珠对于基因组的提取效率明显更高。InhibiEX tablet（一种保护剂）对于核酸的提取效果有明显的抑制作用。

图5：在21种提取方法中选出相对更优的方法，对10种细菌的丰度错误估计以及相对丰度

本篇文章在21种提取方法1~21中筛选出了其中最优的五种15, 7, 6, 9和1，其中三种方法15，6和9用的是凯捷的试剂盒，所以命名为Q，另外两种方法1和方法7命名为H和W。

总结：

在模拟的样本中，10种细菌用不同的提取方法在样本中的评估情况如图5所示，方法O, H和W在样本的处理中均表现出相对很好的效果，其中方法W的效果更优一些。提取方法Q也具有非常好的应用潜能。尽管这三种样本的提取效果已经达到很不错的效果，在这十种细菌中还是表现出了不同程度的丰度错误估计。因此对于样本基因组的提取仍然需要进一步的尝试和发展。详细的实验方法将会在后续整理出完整的实验步骤。