超级细菌专题（二）

专题二

对抗超级细菌的利器-噬菌体裂解酶

 写在前面

上一期关于超级细菌的推送简要阐述了当前除新冠疫情以外，多重耐药细菌和真菌是引起人类疾病和死亡的重要因素。其中超级细菌又是这里面最重要的严重致病菌。上一期推送末尾简单说明了目前除了抗生素以外对付超级细菌的办法，如可以使用噬菌体或者噬菌体裂解酶对抗超级细菌。本文主要是根据本团队的多个研究成果大致介绍噬菌体裂解酶的特性、改造及应用价值。

 什么是噬菌体裂解酶？

噬菌体裂解酶是一类噬菌体基因组上表达的可以专性裂解其宿主菌的蛋白。该蛋白由两个主要的结构域组成：N端是具有催化裂解活性的结构域（catalytic domain，CD），C端是特异性结合宿主细胞壁的结构域（cell wall binding domain，CBD）。目前临床研究应用较多的噬菌体裂解酶是烈性噬菌体在感染细菌后期表达的一类参与细胞裂解的肽聚糖水解酶，也被称为内溶素（endolysin），内溶素的种类多样，相对于噬菌体，内溶素具有相对较宽的宿主谱，部分裂解酶可感染多种细菌。另一方面，相对于抗生素，内溶素又具有较高的特异性，不会杀灭对人体有益的细菌。由于裂解酶的结构特性，可以对裂解酶进行改造从而提高裂解酶的活性并改变宿主谱或者增加其他特性。尤其是针对革兰氏阴性菌或者胞内菌，将内溶素与特定结构域或者多肽进行融合改造是一种较为常见的方式。荷兰生物公司Micreos研发的Staphefekt™SA.100是首个批准用于人体的细胞内溶素，对于耐药性金黄色葡萄球菌具有极强的杀菌活性。噬菌体裂解酶的研究与改造对于对抗耐药细菌具有重要意义。

 噬菌体裂解酶改造相关研究

研究一：细胞穿透肽介导的内化使嵌合裂解酶靶向细胞内病原体

因为裂解酶属于大分子蛋白，较难进入细胞内部，因此很难清除能够在细胞内定植的细菌。本团队曾报道了一种广谱的嵌合裂解酶ClyR，对多种链球菌均有较高的杀菌活性，它具有来自PlyC裂解酶的酰胺水解酶/肽酶催化结构域和来自PlySs2裂解酶的SH-3b细胞壁结合结构域，同时在两个结构域的连接区域具有一个新的细胞穿透肽(CPP)，通过介导，ClyR可以被上皮细胞内化，通过小泡蛋白依赖的内吞作用靶向胞内病原体。研究表明CPP的K153、P154、R169和R188残基对ClyR内化和在细胞内杀伤力至关重要。同时ClyR的内化仅仅对细胞的转录和代谢有微弱影响。这种裂解酶的内化机制能为合理设计改造靶向胞内菌的噬菌体裂解酶提供研究基础。(原文doi: 10.1016/j.ijpharm.2021.120449)

图1：细胞穿透肽介导的嵌合裂解酶内化并靶向细胞内病原体。

研究二：羧甲基壳聚糖纳米凝胶负载的嵌合裂解酶ClyR和无定形磷酸钙具有双重抗龋作用

裂解酶除了上述的应用以外，还可以与一些特殊材料联合使用可为治疗细菌感染提供新的方向。例如本团队曾评估了一种新型材料CMC-ClyR-ACP纳米凝胶的抗生物膜和抗脱矿能力。该纳米凝胶使用羧甲基壳聚糖纳米凝胶负载嵌合裂解酶ClyR和无定形磷酸钙，可以帮助ClyR黏附在病灶区，在对牙釉质变形链球菌生物膜的治疗及牙釉质表面脱矿模型的分析结果表明其能够显著抑制生物膜的活力，并且具有良好的抗脱矿能力。该新型纳米凝胶可以为牙釉质脱矿控制提供一种有效的策略。(原文doi: 10.1111/eos.12784)

图2：新型材料CMC-ClyR-ACP纳米凝胶在透射电子显微镜下的形态。

图3：ClyR与CMC-ClyR-ACP纳米凝胶的抗生物膜活性比较。(A)对变形链球菌进行相应处理2 h，y轴为光密度(OD600 nm)下的细菌浊度; (B)各组生物膜三维叠加投影(活菌-绿色; 死菌-红色; (C) 每一组在沿着z-stack的每一层活细胞百分比分布情况。

图4：(A) ddH2O; (B)CMC-ACP纳米凝胶; (C) CMC-ClyR-ACP纳米凝胶; (D) ClyR和(E) CHX处理后的牙釉质表面扫描电镜图。

研究三：Ca²⁺增强嵌合裂解酶对金黄色葡萄球菌的杀菌活性

此外，我们曾发现某些裂解酶还可以被钙离子增强其杀菌活性。我们曾开展了以金黄色葡萄球菌为目标细菌，通过融合来自裂解酶Ply187的催化结构域和来自裂解酶LysSA97的细胞壁结合结构域，构建了一个新的嵌合裂解酶ClyC，在此基础上我们发现了Ca²⁺能够显著增强ClyC对金黄色葡萄球菌包括MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的杀菌活性。在100 μM Ca²⁺存在的情况下，用50 μg/mL的ClyC处理金黄色葡萄球菌，可使活菌数量在20分钟内降低9个Log值，这是首次观察到具有如此高活性的裂解酶，分析发现在该裂解酶催化域的氨基酸序列中含有一段保守的Ca²⁺结合位点，这为裂解酶与Ca²⁺的相互作用提供基础。此外动物实验模型也证明ClyC可以显著提高小鼠的存活率。(原文doi:10.3390/antibiotics10040461)

图5：Ca²⁺对裂解酶ClyC活性的影响。(A)预测的ClyC的保守的Ca²⁺结合位点(红色标记); (B) SWISS模型预测的ClyC三维结构; (C) Ca²⁺对接到ClyC的结合口袋;(D) 25 μg/mL的ClyC和不同浓度的Ca²⁺对金黄色葡萄球菌T23的杀菌曲线; (E) ClyC (25 μg/mL)和不同浓度的Ca²⁺对金黄色葡萄球菌T23作用1 min时的相对活性。

图6：ClyC保护小鼠免于致命的金黄色葡萄球菌感染。

 写在后面

裂解酶作为一种高效、专性的细菌杀伤/抑制剂已经被较深入研究，已经看见了走向临床应用的曙光。其中部分研究成果已经进入了临床应用且取得了成功。除了裂解酶以外，还有其他方式可以高效对抗超级细菌。这些方式将在后面的推送中被介绍。