SARS-CoV-2低丰度样本的RT-qPCR方法介绍

        随着SARS-CoV-2的广泛传播，各种检测新冠病毒的方法层出不穷。尽管作为SARS-CoV-2核酸检测的“金标准”–RT-qPCR，有着灵敏度高，特异性强的优点，但是临床检测中依然存在部分感染者需多次检测才能检出阳性情况。究其原因还是因为COVID-19患者在感染后的一段时间内上呼吸道病毒载量极低。因此，如何避免由于极低病毒载量导致的RT-qPCR检出假阴性的情况发生。相关研究人员研发了一种基于巢式PCR检测SARS-CoV-2的方法。该方法能显著提升PCR检出下限。

巢式PCR背景介绍

        巢式PCR是一种衍生型的聚合酶链式反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段（一对外引物，一对内引物）。外引物扩增片段和普通 PCR相似。内引物称为巢式引物（因为他们在外引物扩增片段的内部）结合在外引物PCR产物内部，也是核酸检测的靶标引物。内引物扩增片段短于外引物扩增片段。巢式PCR的优势有:1.提高检测灵敏度，因为外引物的扩增可以增加内引物所在片段的丰度。2.特异性强，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。下图为巢式PCR扩增的概念图

巢式PCR原理图

        回到推送话题上，本次推送就以相关研究论文介绍如何利用巢式PCR更灵敏地检测SARS-CoV-2

论文信息
论文题目:One step nested RT-PCR for COVID-19 detection: A flexible, locally developed test for SARS-CoV-2 nucleic acid detection
发表期刊：THE JOURNAL OF INFECTION IN DEVELOPING COUNTRIES
发表时间：2020.06

研究内容

        由于当前巢式PCR有一步法（两轮反应在一个反应管中完成）和两步法（两轮反应在两轮反应管中完成），但两种在灵敏度上没有区别，一步法更加方便操作，所以本篇文章建立的一步巢式PCR检测SARS-CoV-2。

图1.巢式PCR检测的原理及正交实验

        图A：由当1COV、2COV和3COV引物放在一起进行PCR时，它们可以扩增目标片段，并在没有阳性临床参考样本的情况下作为合成阳性对照，以及两对PCR引物所扩增片段的大小。图B:SARS-CoV2的扩增片段与其他近缘冠状病毒对应片段的系统发育树。图C：两对引物的正交实验核酸胶图，其中条带1、7为Marker；条带2,3,5,6是使用一对引物的结果，条带4是同时使用两对引物的结果。1COFw和1CORw引物扩增出183bp的片段，涉及整个区域，2COFw和2CORw引物扩增出67bp的内部片段(巢式PCR)。四个引物的组合产生了四个扩增产物(183bp、130bp、120bp和67bp)。图D：通道1和2，使用两对引物扩增鼻拭子和咽拭子，通道4和5，仅使用引物1COFw和1CORw引物。具体引物信息在表1。

表1.巢式PCR引物的信息

        根据GeneBank中找到SARS-CoV2的核酸序列，设计引物。反应程序设置：按照试剂盒说明书配置好PCR反应体系，加入两对引物。细节参数如下所示

图2.两对引物在实际临床样本检测中的表现

        图A:利用阳性样本和人类内参基因作为对照的核酸胶结果图。图B:用引物1COFw和1CORw对阳性样本进行扩增的核酸胶结果图，条带9到17为阴性对照。图C:利用1COFw和1CORw引物和SYBR Green试剂对合成的新冠阳性样本进行不同稀释的检测结果。

总结

        本次推送简要介绍了一种基于巢式PCR检测新冠的方法。此方法可通过直接RT-qPCR扩增样本，无需RNA纯化，更加便携地检测新冠病毒。该技术提出了使用2对引物的一步巢式RT-qPCR，但可以也可以使用其中的1对引物（Fw和Rw）进行RT-qPCR。因为，如果SARS-CoV-2在其中1对引物扩增关键的位点发生突变，则另外1对引物仍然可以正常扩增。更重要的是，合成病毒序列应根据实验室通过PCR诊断的建议进行管理，以降低污染风险。