宏转录组 vs 扩增子测序

写在前面的
上一次专题详细比较了特异性提高样本中目的病原（SARS-CoV-2）丰度的两种测序方法。扩增子测序（提高SARS-CoV-2的绝对丰度）和目标序列捕获测序（提高SARS-CoV-2的相对丰度）。利用公共数据库PRJNA741220评估了两种测序方法的测序效果。从测序深度及覆盖度上，扩增子测序均相对于目标序列捕获测序具有更好的效果和精度。从上一次结果看，尽管扩增子测序优越于目标序列捕获测序，但是SARS-CoV-2基因组上仍然有一部分区域没有有效覆盖。本次专题，我们再次以宏转录组和扩增子测序两种方法为对象，比较二者在新冠基因组测序中的差异性。

背景介绍

        宏转录组（Metatranscriptomic Sequencing）（日常科研中也经常以宏基因组或mNGS命名）。因为SARS-CoV-2属于RNA病毒，采用普通的宏基因组（Metagenomic Sequencing）策略无法完成RNA病原建库。所以针对新冠的宏基因组测序（口头名称）实际上是宏转录组测序。本次推送选择了编号为PRJNA720544的公共数据对扩增子测序和宏转录组测序进行比较分析。该批公共数据使用对致死性新冠肺炎患者的肺组织标本进行两种方法的病毒序列分析。基于扩增子测序（n = 8）和基于单细胞的宏转录组测序（n = 27）。严格意义上说，这批样本中的宏转录组采用的是单细胞测序的建库模式，还不是一般意义的普通宏转录组测序。由于这一次的推送属于新冠基因组测序专题。后期会开设微生物组专题以介绍宏转录组相关知识。

数据比较

        按照上一次推送定义的指标。本次依然按照三个指标初步评价两种测序模式对新冠基因组测序的效果。

全基因组平均测序深度

图1.全基因组平均测序深度
        

         如图1所示，可以明显看出基于mNGS的测序模式在基因组平均测序深度统计指标中存在明显大的方差。体现出低精度。有3个样本的平均测序深度接近0.约一半样本的平均测序深度低于100x。相比之下，扩增子测序体现出极高的精度。几乎每个样本的平均测序深度都在1000x左右。

全基因组覆盖度

图2.全基因组覆盖度

        同样，基于mNGS的测序模式在全基因组覆盖度上仍然体现了极低的精度。超过一半的样本存在低于50%的全基因组覆盖度。这种超低的覆盖度难以获得新冠基因组，对变异分析造成了极大的困难。相比之下，扩增子测序的方式覆盖度最低也超过了75%。由此可见，基于宏转录组测序的模式只能鉴定是否有无新冠，但是对于新冠基因组的变异分析或溯源分析都存在不可忽视的短板！

单位窗口基因组测序深度

图3.单位窗口基因组测序深度

        前面的结果似乎都在提示，使用宏转录组分析新冠的基因组不是一个好方法。或许，我认为图3的结果在另一个角度体现出使用宏转录组分析新冠基因组的优越性！粗看图3，似乎基于扩增子测序的方式仍然体现了较高的平均覆盖度。但是，请注意图3的尾部，可以明显看出mNGS在新冠基因组3’末端具有显著高于扩增子测序的深度。由于mNGS的测序模式属于无偏移测序（unbiased sequencing），每一段被测序的RNA都能尽最大可能保留其真实丰度。也就是说，在实际的样本中，新冠的RNA丰度在其基因组（RNA）的3’末端具有非常高的转录水平!该位置有包含了N基因和ORF10基因。事实上，宏转录组带来的新冠RNA数据可以真实的反映新冠RNA在实际样本中的丰度差异。这对于指导设计新冠特异性荧光定量PCR引物具有显著的意义！因为在临床SARS-CoV-2分子诊断中，RT-qPCR仍然被认为是最准确的诊断方式。但是由于新冠病毒在部分样本中病毒拷贝数低（如咽拭子，鼻拭子等）。选择一段RNA拷贝数高的区域（注意这里的病毒拷贝数和RNA拷贝数不同）有助于提高核酸检测的准确性。因此，宏转录组可以指导病原分子诊断专家如何选择有价值的新冠核酸检测靶标。

宏转录组测序的其他优势

        全面，直观，真实是宏转录组的三大优势。这里引用一下我们所一位优秀的师姐发表的利用宏转录组数据解析COVID-19疾病特征的论文。

图4.宏转录组数据在COVID-19中应用（Lu B, Yan Y, et al Cell Discov. 2021 Mar 30）

        首先，宏转录组数据不仅可以鉴定新冠的有无，还可以在一定程度上复原新冠的基因组。其次，宏转录组数据可以挖掘COVID-19病人病灶部位其他共感染病原微生物。例如，分析二次感染致病菌、分析共生微生物的抗性基因（Lu B, Yan Y, et al Cell Discov. 2021 Mar 30），为药物使用提供有价值的指导。此外，除去微生物组部分，宏转录组还包含了大量宿主转录组数据，利用宿主转录组数据还可以挖掘宿主免疫、代谢相关反应。为临床治疗提供有效数据。

写在后面的
扩增子测序的确在高效解析新冠基因组数据中发挥了极显著的优势。相比于扩增子测序，基于宏转录组（Metatranscriptomic sequencing或mNGS）的方法虽然在获取完整新冠基因组上存在高成本的缺陷，但是由于其无偏移测序的特征，目标病原的基因表达水平可以被真实反应。对于指导设计特异性逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）的引物探针具有显著意义。同时，宏转录组数据覆盖全面，共生微生物的抗性基因、二次感染病原及宿主免疫、代谢反应均能有效反应，对于深入挖掘COVID-19疾病指导临床治疗具有显著意义！

参考文献

Lu B, Yan Y, Dong L, Han L, Liu Y, Yu J, Chen J, Yi D, Zhang M, Deng X, Wang C, Wang R, Wang D, Wei H, Liu D, Yi C. Integrated characterization of SARS-CoV-2 genome, microbiome, antibiotic resistance and host response from single throat swabs. Cell Discov. 2021 Mar 30;7(1):19. doi: 10.1038/s41421-021-00248-3. PMID: 33785729; PMCID: PMC8008776.