qPCR的谜之假阳性

实验目的：

在实验之余的时间内，我闲着无聊试着比较了一下常用细菌基因组核酸提取过程中破碎珠和溶菌酶对于金黄色葡萄球菌细胞壁的破碎效果。用破碎珠和溶菌酶分别处理金黄色葡萄球菌样本。

实验预处理：

把金黄色葡萄球菌培养液稀释，利用OD600=1.0时，金黄色葡萄球菌浓度大约是1.5X109个细菌/ml，稀释一千倍大约为1.5X106个细菌/ml（稀释用的PBS为之前配制，使用前过0.22微米滤器），每次取菌样300微升，使得溶液中金黄色葡萄球菌总数大约为4.5X105个。加入180微升溶菌酶（20mg/ml，溶菌酶（公用溶菌酶，-20℃保存）使用前先用0.22微米滤器（一次性的）过滤除菌）和破碎珠（二月初曾灭菌处理过一次，以后每次使用前再进行分装）分别处理金黄色葡萄球菌，溶菌酶处理组在37摄氏度水浴30min（这一步可以破碎大部分的革兰氏阳性菌对于某些细胞壁特别难破碎的细菌可以适当延长水浴时间。破碎珠处理组用最大涡旋速度涡旋10min，瞬时离心后取上清（不要取到破碎珠），用以破碎金黄色葡萄球菌。同时设置阴性对照（300微升菌液用PBS代替，其他处理和实验组一致）所有操作过程均在生物安全柜内进行。

实验流程：

实验试剂：

Buffer WA、Buffer WB以及Elution Buffer，均为新打开的。Buffer WA和Buffer WB在使用之前都按照要求加入了一定量的无水乙醇。Elution Buffer在使用前55℃水浴加热，可以提高核酸洗脱效率。洗脱柱和套管均为试剂盒自带，收集管为1.5ml灭菌处理过的。所有试剂均在生物安全柜内打开。

使用诺维赞的基因组提取试剂盒提取样本核酸，具体实验步骤见实验流程。每组做两个生物学重复。两个阴性对照（300微升菌液用PBS代替，其他处理和实验组一致）。一共八个样本，加上两个PCR阴性对照（用DEPC水代替样本加入配好的PCR反应mix中）。共18个PCR结果。在二楼诊断室反应体系配置室配制18微升PCR反应的mix，通过传递窗将mix传递到模板加样室，加入5微升模板（提取的核酸样本），使得总反应体系为20微升。

PCR反应体系：

SYBR Green Mix：10微升

引物F:0.4微升

引物R：0.4微升

dd水：4.2微升

模板：5微升

利用ABI的仪器进行qPCR。

PCR反应结果如表一

表一

PCR程序如表二

表二

PCR的溶解曲线如图一：

图一

看到表一PCR结果就会觉得很奇怪，为什么阴性对照也能出现阳性的结果，但是看溶解曲线峰值又很单一，就是说污染和实验处理组的模板是一样的按道理阴性对照没有模板应该不会有结果的。使用引物为16s引物通用引物（16s引物的扩增片段较长，大约500bp，所以PCR设定的延伸时间较长。以后所用的引物换为NUC引物，扩增片段较短，大约为100bp，延伸时间不需要很久，设置为20秒）。为了找到出现假阳性的原因，第一个怀疑的就是因为16s引物扩增的特异性不强导致非特异性扩增增加以及是不是因为我作为阴性对照的水是由细菌污染的，因此换用黄色葡萄球菌的特异性引物NUC和重新换一管水做PCR。阴性对照设置一个就可以说明问题，于是阴性处理只选一组进行

PCR反应体系：

SYBR Green Mix：10微升

引物F:0.4微升

引物R：0.4微升

dd水：4.2微升

模板：5微升

使用Bio-rad仪器进行qPCR

PCR结果如表三

表三

因为PCR设置溶解曲线一般都是用系统默认的，所以从这一步开始的溶解曲线不再用反应体系建议的，只用PCR仪器默认的。

PCR程序如表四

表四

溶解曲线如图二。

图二

换用了特异性更强的引物来进行PCR，但是PCR结果仍出现假阳性，进一步分析原因可能是由于提取过程中出现操作不当，把阴性对照中混入了阳性样本，导致实验对照组出现和阳性组一样的结果，因此，只做阴性处理，所有需要用的细菌的都用PBS代替进行后续操作（这总不可能在阴性样本中混入阳性样本了吧）。假设出现阴性结果，就说明是由于操作过程中把阳性样本污染到阴性对照中。如果出现阳性结果，就说明可能是提取试剂被污染，或者提取试剂本身存在问题。但是为了防止是因为在这次操作过程中由于忘记加入某些试剂的原因引起的阴性结果，所以在 PCR配制体系中加入一个阳性样本作为阳性对照。

PCR反应体系：

SYBR Green Mix：10微升

引物F:0.4微升

引物R：0.4微升

dd水：7.2微升

模板：2微升

模板加入量2微升就可以达到实验要求，于是在这一步开始以后的PCR减少了模板的加入。

PCR结果如表五

表五

PCR过程如表六

表六

溶解曲线如图三。

图三

做到这里可以看到假阳性问题依然存在，并且溶解曲线的峰值非常单一，这个现象就非常神奇了，于是推测是否是因为SYBR Green Mix 的问题，因此将SYBR Green Mix换成One-Step SYBR Green Mix做qPCR（One-Step SYBR Green Mix我同学用RNA来进行PCR，且不说结果好不好，但是阴阳性是可以区分开的）。

PCR反应体系

SYBR Green Mix：10微升

SYBR Green Enzyme Mix：0.4微升

引物F:0.4微升

引物R：0.4微升

dd水：3.8微升

模板：2微升

PCR结果如表七

表七

PCR反应程序如表八

表八

溶解曲线如图四

图四

感觉做到这里感觉已经非常接近事实的真相了，排除了所有可能的原因，只剩下引物。于是猜测可能是引物在操作时不小心引入细菌污染，测引物是否污染，设计实验，用16S引物去做PCR，相应的模板为NUC引物的正反链。阴性对照依然选择超纯水。

实验结果如表九

表九

PCR程序如表十：

表十

溶解曲线如图五

图五

做到这里就很崩溃，引物，模板，水，反应mix，几乎把PCR体系中能换的东西换了个遍，但是阴性结果依然没有出现它本应该出现的结果。后来老师查到之前有人发过相似的帖子，说用SYBR-Green做半定量分析目的基因的表达，以质粒作为模板的标准曲线还是很好的，但是阴性对照总是出现信号，质粒和水都是换了很多次都没有什么改变，这也就说明可能是由于染料法PCR本身存在一定的问题，于是选择特异性更强的探针法PCR来测试实验结果。探针法相较于染料法特异性更强，只能和目的片段结合，被检测到。

探针法PCR结果如表十一：

表十一

A6,A7,B6,B7是破碎珠处理样本；C6,C7是破碎珠阴性处理样本；D6,D7,E6,E7是溶菌酶处理实验组；F6,F7是溶菌酶处理阴性对照；G6,G7是水的阴性对照。

实验结论

探针法pcr的结果说明相较于溶菌酶处理组，破碎珠处理的样本破碎效果更好，提取的核酸浓度更高。

由此可以看出，染料法本身可能存在一些问题，容易导致假阳性的出现，因此当实验出现问题的时候，需要多考虑几多方面的原因，利用不同的实验方法进行验证。